بررسی انتقال ژن پروانسولین انسانی به گیاه خیار به روش اگروباکتریوم

امروزه مردم زیادی در جهان، به نوعی از دیابت مرتبط با انسولین رنج می برند. همچنین تخمین زده شده است که در آینده ای نزدیک تعداد افراد مبتلا به دیابت دو برابر خواهد شد. همراه با افزایش تعداد بیماران دیابتی در دنیا، افزایش تقاضا برای هورمون انسولین (با رشد 3 الی 4 % در سال) قابل پیش بینی است. روبرو شدن با این میزان تقاضا، توسع? روش های ارزان، مقرون به صرفه و با ظرفیت تولید بالا را برای آینده ضروری می نماید. با توجه به پتانسیل بالای گیاهان برای تولید زیست داروها، با بهره گیری از زراعت مولکولی(mulecular farming) تولید و عرض? انسولین با استفاده از گیاهان نیز می تواند چشم انداز نوید بخشی باشد.به همین منظور، در این تحقیق انتقال ژن پروانسولین انسانی به گیاه خیار مورد بررسی قرار گرفت. مهمترین مرحله در انتقال ژن بدست آوردن باززایی موفق از گیاه است، بنابراین نهادینه شدن کشت بافت خیار اولین گام در انتقال ژن پروانسولین به آن است. با توجه به نبود هیچ گزارشی در مورد باززایی و کشت بافت ارقام خیار ایرانی، در این تحقیق ابتدا کشت بافت و باززایی مستقیم خیار واریت? اصفهان، با آزمون 40 تیمار هورمونی مختلف، نهادینه شد. به منظور انتقال ژن، از باکتری اگروباکتریوم، سوی? lba4404 دارای ناقل pcambia1304 حاوی ژن پروانسولین تحت کنترل پیشبرند? camv 35s، استفاده شد. جهت انتقال ژن، ریزنمونه های کوتیلدونی با اگروباکتریوم تلقیح شده و پس از هم کشتی، به محیط باززایی حاوی آنتی بیوتیک منتقل شدند. جوانه های باززایی شده در محیط کشت انتخابی، جهت افزایش رشد ساقه و ریشه زایی به محیط کشت دیگری منتقل شدند. گیاهچه های تراریخت حاصل، پس از سازگاری با محیط، به گلدان و گلخانه منتقل شدند. گیاهان خیار تراریخت پس از طی مراحل رشدی، ابتدا تولید گل و سپس میوه نمودند. بذرگیری از میوه های گیاهان تراریخت به منظور آنالیز آن ها در نسل دوم، صورت پذیرفت. آنالیز گیاهان تراریخت خیار در سه سطح dna، rna و پروتئین انجام شد. آنالیز در سطح dna به روش آزمون pcr، با استفاده از آغازگرهای اختصاصی انجام شد و بدین ترتیب، با تکثیر ژن پروانسولین، تراریختی گیاهان تأیید شد. به منظور بررسی بیان ژن پروانسولین منتقل شده به خیار، با استخراج rna از گیاهان تراریخت و شاهد و استفاده از آزمون rt-pcr ، بیان ژن پروانسولین در سطح rna به تأیید رسید. به منظور آنالیز بیان پروتئین، از سه روش sds-page ، دات بلات و لومینسانس الکتروشیمیایی (electrochemiluminescence) استفاده شد. در نتایج حاصل از بررسی در سطح پروتئین، حضور و بیان پروتئین نوترکیب پروانسولین در گیاه تراریخت نیز تأیید شد.